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  溃疡性结肠炎模型大鼠NF-κB活性等的表达及芪倍合剂的干预作用
 
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溃疡性结肠炎模型大鼠NF-κB活性、NF-κB mRNA及TNF-α mRNA的表达及芪倍合剂的干预作用

发表时间:2012-3-23 13:40:51 来源:创新医学网医学编辑部推荐

  张超贤1,郭李柯2,郭晓凤3  作者单位:1. 新乡医学院第一附属医院消化内科,河南卫辉 453100;2. 新乡医学院第一附属医院口腔科,河南卫辉 453100;3. 杭州市第六人民医院,浙江杭州

  【摘要】目的观察芪倍合剂对溃疡性结肠炎模型大鼠NF-κB活性、NF-κB mRNA及TNF-α mRNA表达的影响并探讨与抗脂质过氧化有关的作用机制。方法 雄性SD大鼠75只,随机分为正常对照组、模型组和芪倍合剂小剂量治疗组[1.5 mL/(100 g?d)]、中剂量治疗组[2.0 mL/(100 g/d)]、大剂量治疗组[2.5 mL/(100 g/d)]。以三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇溶液灌肠诱导大鼠溃疡性结肠炎模型,治疗组造模同时给予芪倍合剂灌肠,共4周。造模4周后处死大鼠取结肠组织标本,光镜观察结肠组织的病理变化,并对结肠组织标本进行病理评分;免疫组化法测定结肠黏膜NF-κB活性,RT-PCR法检测结肠组织中NF-κB mRNA和TNF-α mRNA的表达,放射免疫法测定血清丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、GSH-Px的活性。结果 与正常对照组比较,模型组结肠组织病理评分、MDA含量、NF-κB活性及TNF-α mRNA的表达显著增加(P<0.01),而血清SOD、GSH-Px的活性明显下降(P<0.01);与模型组比较,治疗各组病理评分、MDA含量、NF-κB的活性及TNF-α mRNA的表达显著下降,而血清SOD、GSH-Px的活性明显上升(P<0.05或P<0.01)。NF-κB的活性及TNF-α mRNA的表达呈正相关关系(r=0.570,P<0.05),各组NF-κB mRNA的表达均为阳性,无显著性差异(P>0.05)。结论 芪倍合剂能显著降低实验性溃疡性结肠炎大鼠的NF-κB的活性、TNF-α mRNA的表达,从而减轻结肠组织损害程度,这与其抑制抗脂质过氧化作用密切相关。

  【关键词】 芪倍合剂;溃疡性结肠炎;脂质过氧化;核转录因子-κB活性;肿瘤坏死因子-α

  ABSTRACT: Objective To observe the effects of Qibei mixture on NF-κB activity, NF-κB mRNA and TNF-α mRNA expressions and to explore its mechanisms related to anti-lipid peroxidation in rats with ulcerative colitis. Methods Totally 75 male SD rats were randomly divided into five groups: normal control group, model control group and Qibei mixture groups with low dose [1.5 mL/(100 g?d)], medium dose [2.0 mL/(100 g?d)] and high dose [2.5 mL/(100 g?d)]. The combined enema of trinitrobenzene sulphonic acid (TNB) and ethanol was administered intrarectally for 4 weeks to induce ulcerative colitis. At the same time of modeling, Qibei mixture was poured into the intestinal cavity in Qibei mixture group. The rats were killed after 4 weeks. The histomorphological structure of the colon tissue was observed under optical microscope, and the lesion degree of colon tissue was evaluated by a pathologic grading system. NF-κB activity in the colon mucosa was determined by immunohistochemical method; NF-κB mRNA and TNF-α mRNA expressions were measured with the methods of RT-PCR. And the levels of MDA, SOD and GSH-Px in serum were determined by radioimmunoassay. Results Compared with those in normal control group, the pathologic grading score, MDA content, NF-κB activity and TNF-α mRNA expression were increased obviously (P<0.01), while the level of serum SOD and GSH-Px activity

  核转录因子-κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)是一种能与体内多种细胞基因启动子部位相结合的核蛋白,在机体的免疫和炎症反应、凋亡调控等方面发挥重要作用,其过度活化可引起多种病理生理反应。国内外研究表明,NF-κB在溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)中呈现过度激活状态,导致并调控UC患者的细胞因子及黏附分子等过度和持续的表达,放大炎症反应,从而参与了UC肠道的炎症和免疫反应[1]。而氧化应激通路是调控NF-κB的重要途径[2]。我院自制复方中药芪倍合剂对UC有良好的治疗作用[3]。但是,这种作用是否与抗氧化应激、抑制NF-κB活性及下游炎症因子的表达有关尚不清楚。本实验通过观察大鼠实验性UC时NF-κB活性、TNF-αmRNA及氧化应激代谢产物丙二醛的变化及芪倍合剂处理对其的影响,进一步探讨芪倍合剂治疗UC的作用机制。

  1 材料与方法

  1.1 材料

  成年雄性健康清洁级SD大鼠75只,体重200~220 g(由新乡医学院实验动物中心提供),芪倍合剂为我院根据张仲景之大黄附子汤加味研制的一种灌肠剂,由黄芪、大黄、五倍子、白芨等8味中药组成(批号070824),2、4、6-三硝基苯磺酸(TNBS, Sigma公司);无水乙醇(分析纯,北京化工厂)。NF-κB鼠单克隆抗体(Santa Cruz公司)。DelDoc2000凝胶扫描仪(BLO-Rad公司,美国),Trizol试剂(美国Invitrogen公司),TNF-α、NF-κB及β-actin引物(上海生工生物工程公司),RT-PCR(一步法)试剂盒(宝生物工程有限公司)。SOD、GSH-PX、MDA 检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

  1.2 实验动物分组与模型制作方法

  SD大鼠术前禁食24 h,自由饮水,随机分为5组:正常组、模型组、芪倍合剂小剂量组、中剂量组和大剂量组各15只。正常对照组不造模,模型组和治疗组参考文献[4]方法造模,腹腔注射100 mL/L的水合氯醛使大鼠轻微麻醉,而后将一直径2.0 mm、长约12 cm的硅胶管用石蜡油润滑,由肛门轻缓插入大鼠体内深约8 cm,缓慢注入含100 mg/kg TNBS的等容积无水乙醇溶液,然后提起大鼠尾部,持续倒置10 min,使造模剂充分渗入大鼠肠腔内。造模后,自然清醒,自由饮食。造模后第3天,各组开始给药,连续4周。芪倍合剂各组分别按1.5 mL/(100 g?d)、2 mL/(100 g?d)、2.5 mL/(100 g?d)灌肠。正常组和模型组以等体积0.85氯化钠灌肠。实验4周后,氯氨酮麻醉下,将动物取仰位固定于手术台上,取左侧第3~4肋间逐层切开暴露胸腔,寻找下腔静脉,并抽血约4 mL,离心获取血清待检;处死动物并剖腹,快速切取结肠组织供实验用。

  1.3 结肠组织的病理观察

  取病变最明显处组织置于100 mL/L福尔马林液溶液固定,常规石蜡包埋,HE染色, 用于结肠组织形态观察、光镜观察。结肠病理积分评分标准参照相关文献[5]的标准。

  1.4 血清SOD、GSH-Px活性及MDA含量的测定

  MDA的测定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法,SOD的测定采用黄嘌呤氧化法,谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性测定用DTNB直接法。

  1.5 NF-κB活性的检测

  结肠4 μm厚石蜡切片,常规脱蜡,乙醇梯度脱水,30 mL/L H2O2灭活内源性过氧化物酶以修复抗原,50 mL/L羊血清封闭30 min,10 mL/L的NF-κB P65(一抗)37 ℃孵育1 h,滴加羊抗兔IgGHRP室温15 min,DAB显色,苏木素复染,切片烤干封片。阴性对照用PBS代替一抗。阳性反应细胞胞浆、胞核呈棕黄色染色。在3个高倍镜视野下观察阳性细胞数N1和总细胞数N,阳性率=N1/N×100%。

  1.6 NF-κB mRNA的检测

  采用RT-PCR法检测NF-κB mRNA,NF-κB p65引物序列:上游5′-GAAGAAGCGAGACCTGGAG-3′,下游5′-TCCGGAACACAATGGCCAC-3′,扩增产物长度398 bp。内参β-肌动蛋白序列:上游5′-TCCTAGCACCATGAAGATC-3′,下游5′-AAACGCAGCTCAGTAACAG-3′,扩增产物长度190 bp。PCR条件:各扩增管先置于55 ℃水浴逆转录40 min,然后直接置PCR扩增仪94 ℃变性45 s,54 ℃退火45 s,72 ℃延伸60 s,共40个循环,再72 ℃延伸5 min,PCR产物在15 mL/L琼脂糖凝胶上电泳,在凝胶成像系统中计算NF-κB p65 mRNA与β-肌动蛋白的吸光度比值。

  1.7 TNF-α mRNA的检测

  用Trizol(Invitrogen公司)抽提RNA后,RT-PCR半定量法检测mRNA表达量,以β-actin为内参照。TNF-α上游引物序列:5′-TCTCAAAACTCGAGTGACAAG-3′;TNF-α下游引物序列为:5′-AGTTGGTTGTCTTTGAGATCC-3′,产物长度446 bp;设β-actin为内参照,其上流引物序列为5′-TGGTACCACTGGCATTGTGA-3′,下游引物序列为5′-TCCTGCTTGCTGATCCACAT-3′,产物长度545 bp。反应条件:50 ℃ 1 h,90 ℃ 5 min;94 ℃ 30 min,65 ℃ 30 min,68 ℃ 1 min 30个循环;65 ℃延伸2 min,4 ℃保存。2.0 g/L的琼脂糖凝胶电泳,在凝胶成像系统中计算TNF-α mRNA与β-肌动蛋白的电泳条带的吸光度比值。

  1.8 统计学处理

  用SPSS11.5统计学软件进行分析,数据以均数±标准差(x-±s)表示,组间比较经方差齐性检验示方差齐,进行单因素方差分析。相关分析采用直线相关的积差相关分析,以P<0.05为有统计学意义。

  2 结  果

  2.1 病理形态学的表现

  在光镜下正常组大鼠结肠黏膜上皮完整、连续,腺体排列规则、结构清楚,无溃疡、无糜烂点及淋巴细胞浸润。模型组大鼠结肠黏膜可见多个溃疡出现,糜烂点散在分布,黏膜淋巴细胞浸润严重,杯状细胞减少明显。治疗组在溃疡数、糜烂点个数均较模型组明显减少,同时炎症细胞浸润和杯状细胞减少程度也较轻。

  2.2 芪倍合剂对大鼠MDA含量、SOD、GSH-Px活性、NF-κB活性、NF-κB mRNA和TNF-α mRNA表达的影响

  模型组血清MDA含量、结肠组织NF-κB活性与TNF-α mRNA表达较假手术组显著增高,SOD、GSH-Px活性显著降低(P<0.01),治疗组MDA含量、NF-κB活性及TNF-α mRNA表达明显低于模型组,SOD、GSH-Px活性显著升高(P<0.05或P<0.01),NF-κB活性与TNF-α mRNA呈正相关关系(r=0.570,P<0.05),模型组NF-κB mRNA较假手术组有所升高,治疗组较模型组有所降低,但差异无统计学意义(P>0.05)(表1、图1、图2)。表1 各组大鼠病理评分、MDA含量、SOD和GSH-Px活性、NF-κB活性、TNF-α mRNA及NF-κB mRNA表达的比较图1 各组结肠组织NF-κB mRNA的表达M:Maker;1:正常组;2:模型组;3、4、5:芪倍合剂低、中、高剂量治疗组。,图2 各组结肠组织TNF-α mRNA的表达 M:Maker;1:正常组;2:模型组;3、4、5:芪倍合剂低、中、高剂量治疗组。

  3 讨  论

  TNF-α是一种促炎症细胞因子,是机体炎症反应与免疫反应应答的重要调节因子[6],可使中性粒细胞聚集,产生呼吸爆发、脱颗粒,对淋巴细胞有刺激作用,可上调趋化因子IL-8的表达[7],IL-8可进一步通过对中性粒细胞的趋化作用,导致肠组织内各种炎症细胞浸润[8]。此外,TNF-α可增强干扰素γ(IFN-γ)诱导的组织相容性复合物(MHCⅡ)的表达,协同IFN-γ改变肠道上皮的屏障功能,还可诱导肠上皮细胞的凋亡。在IL-6的参与下,诱导凝血酶形成,使小血管在炎症基础上形成微血栓,导致黏膜微循环障碍。还可激活磷脂酶,继而生成白三烯和氧自由基等。TNF-α可通过上述过程参与溃疡性结肠炎的发病,为UC发病机制中的启动因子。NF-κB活化是众多炎症介质作用机制的共同通道,生理情况下NF-κB同其抑制因子(inhibitor of NF-κB, IκB)结合以无活性状态存在于细胞浆内;疾病过程中,内毒素、脂多糖、磷脂酶A、溶血磷脂酰胆碱、氧化应激代谢产物、病毒、缺血-再灌注等均可使IκB和NF-κB分离,NF-κB便迅速活化,然后进入细胞核,与其靶基因上的启动子或增强子结合而调节基因转录,激活与细胞应激相关的基因和炎症早期反应基因,如细胞因子、生长因子和急性期蛋白等,产生大量的包括TNF-α、IL-1β等炎症因子。另外,TNF-α等细胞因子也可以通过激活NF-κB诱导激酶(NIK)和丝裂原蛋白激酶的激酶1(MEKK1),使IKK磷酸化而激活,激活后的IKK再使IκB磷酸化,后者最后被蛋白酶降解,从而使NF-κB游离出来而活化,使信号进一步放大[9]。大量研究表明,NF-κB在UC中高度表达并诱导TNF-α、IL-1β、IL-6大量表达而在UC中发挥重要的作用[10]。研究显示,NF-κB抑制剂能显著减少结肠黏膜炎症细胞浸润,降低TNF-α、IL-6等细胞因子的基因表达,有效改善结肠组织炎症反应,说明NF-κB在UC的发生与发展中发挥重要枢纽作用[11-12]。另研究表明,在发生UC时,中性粒细胞和巨噬细胞都产生氧自由基O2和H2O2,过剩的O2和H2O2相互作用产生HO。它使细胞膜不饱和脂肪酸过氧化,且脂质过氧化产物生成增加,可损伤生物膜,导致膜的结构破坏,通透性增加,甚至胞膜破裂,蛋白水解酶等有害成分溢出,还可引发膜上一系列酶的活性改变,启动新的自由基反应。MDA是自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸而引发的脂质过氧化作用的最终分解产物,其含量可反映机体内细胞脂质过氧化的程度[13-14]。SOD是体内存在的一种抗氧化酶,它对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用。它能将氧自由基歧化为H2O2。H2O2进一步在过氧化氢酶(CAT)、GST-Px的催化下被清除,从而保护细胞免受损伤。联合检测血清MDA含量和GST-Px及SOD的活性,能间接反映机体脂质过氧化反应对组织的损伤程度。本研究显示,NF-κB活性、TNF-α mRNA与血清MDA含量呈同方向变化,而GST-Px与SOD活性呈反方向变化。这验证了氧自由基和脂质过氧化物可能是NF-κB的重要刺激物。所以,可以说氧化应激通路通过直接或间接方式在UC发生、发展中发挥着重要作用。提示通过抗脂质过氧化、抑制NF-κB活化进而下调TNF-α mRNA表达是有效改善结肠黏膜炎症损伤的一个重要途径。

  本研究显示,模型组大鼠结肠组织NF-κB活性、TNF-α mRNA表达与正常对照组比较明显增高(P<0.01),两者呈同一化的进程,且与病理上结肠炎症损害严重程度相平行。这印证了细胞因子在体内呈现网络式的调节,在UC的发生、发展过程中发挥着重要作用。研究显示,大鼠结肠组织中NF-κB mRNA在各组间表达差异不明显,提示NF-κB的活性并非完全由NF-κB mRNA表达所决定。NF-κB mRNA的表达从分子角度反映了基因的转录水平,转录水平越高,NF-κB表达的数量越多,一定程度上就可提高NF-κB的活性。但是,NF-κB活性变化是受多因素影响的,在UC发生发展过程中,NF-κB活性的增强主要是因为脂质过氧化等活化因素的变化导致,而非NF-κB mRNA表达增多所致。所以,抑制NF-κB活性的有效手段是减少NF-κB活化因素、阻断NF-κB活化途径。

  芪倍合剂为我院根据张仲景之大黄附子汤加味研制的一种灌肠剂,由黄芪、大黄、五倍子、白芨等8味中药组成,具有健脾益肾、涩肠止泻之功效,用于治疗直肠炎及慢性UC。本研究显示芪倍合剂能显著降低大鼠模型结肠组织的NF-κB活性和TNF-α mRNA的表达,表明其能抑制NF-κB活性,下调TNF-α等多种炎性因子基因的表达,使炎症介质、细胞因子的产生减少,减轻UC的炎症反应,其机制可能是:①UC发生时机体内氧自由基产生增加,大量产生的氧自由基一方面引发链式脂质过氧化反应损伤细胞膜,产生大量脂质过氧化物,后者是NF-κB的重要刺激物。而黄芪有效成分硒、黄芪多糖、木糖-葡萄糖-环黄芪醇可启动DNA修补酶、刺激抗体产生、清除有害自由基,抑制脂质过氧化物的生成;另外的研究显示,大黄中大黄素也有显著清除氧自由基,抑制脂质过氧化的作用[15]。②黄芪甲苷可阻止TNF-α、细菌脂多糖 诱导NF-κB的核移位与靶基因的κB位点的结合,从而抑制TNF-α等相应基因的转录[16]。另外,大黄素可抑制一组与炎症相关的基因的表达,包括TNF-α、iNOS、IL-10、细胞浆IκB-α、IκK-α和IκK-γ以及抑制NF-κB的核转位。因此,认为大黄素是通过调控炎症细胞因子尤其是抑制NF-κB活化来发挥它的抗炎作用[17]。这就从基因分子水平角度解释了芪倍合剂治疗UC的机制。

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