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  川芎嗪对大鼠肾脏缺血/再灌注损伤保护作用及抗细胞凋亡作用
 
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川芎嗪对大鼠肾脏缺血/再灌注损伤保护作用及抗细胞凋亡作用

发表时间:2012-3-21 9:46:01 来源:创新医学网医学编辑部推荐

  王汉民,谭华,赵洪雯,张鹏,黄朝晖  作者单位:第三军医大学西南医院肾脏内科,重庆 400038,第四军医大学西京医院肾脏内科,陕西 西安 710033

  【摘要】 目的: 探讨川芎嗪对缺血/再灌注(I/R)损伤大鼠肾功能、肾脏组织形态学、细胞凋亡及相关基因表达的影响. 方法: 将大鼠随机分为假手术(S)组、I/R组、再灌注后给予川芎嗪(TMPpost)组、再灌注前给予川芎嗪(TMPpre)组,各组分别采用化学法测定血尿素氮和肌酐,光镜和电镜观察肾组织形态学变化,原位末端标记法检测肾脏细胞凋亡指数,免疫组化和免疫印迹法检测肾脏Bcl2和Bax蛋白的表达. 结果: TMPpre组较I/R组血尿素氮和肌肝显著降低,肾小管损伤评分减轻,分别为[(21.8±5.2)vs (31.1±4.4) mmol/L,P<0.01) ],[(196±55)vs (295±64)μmol/L,P<0.01)],[(372±46) vs (563±62),P<0.01) ];肾小管上皮细胞损伤及超微结构改变明显减轻,肾组织凋亡细胞数明显减少[(13.6±2.9) vs (28.8±4.6),P<0.01)];Bcl2蛋白表达明显增强[(1.15±0.12) vs (0.88±0.12),P<0.05)],Bax表达明显减弱[(0.87±0.11) vs (1.15±0.09),P<0.05)]. 结论: 川芎嗪可明显减轻I/R肾损伤,其保护作用机制与Bcl2蛋白表达增强和Bax蛋白表达减弱介导的肾脏细胞凋亡有关.

  【关键词】 川芎嗪;肾脏;再灌注损伤;细胞凋亡;保护

  【Abstract】AIM: To explore Ligustrazine (Tetramethylpyrazine, TMP) on the effect of in rats wit rat renal functions, renal tissue morphology, cell apoptosis and expressions of related genes in rats with. METHODS: Forty Wistar rats of either sex were randomly divided into 4 groups, which were sham operation(n=10), I/R model(n=10), TMPpost (n=10, intraperitoneal TMP 32 mg/kg per 6 h after reperfusion for 30 min) and TMPpre (n=10, intraperitoneal TMP 32 mg/kg at 45 min, 8, 16, 24 h before ischemia) groups. Blood urea nitrogen and creatinine were detected by chemical method. Renal cell apoptotic index was examined by means of terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labeling(TUNEL). The expressions of Bcl2 and Bax in kidney was immunohistochemically evaluated and quantified by Western Blot analysis. The kidney histology were observed by light and electron microscope. RESULTS: Compared with those in the TMPpre group, the blood urea nitrogen[(21.8±5.2)vs (31.1±4.4) mmol/L,P<0.01], the creatinine [(196±55) vs (295±64)μmol/L,P<0.01)] and the score of injury in renal tubules [(372±46) vs (563±62),P<0.01) ] were decreased significantly in I/R group. The changes of injury and ultrastructure in tubular epithelial cells were significantly attenuated in TMPpre group. By Tetramethylpyrazine pretreatment, the apoptotic index (13.6±2.9 vs 28.8±4.6, P<0.01) and the expression of Bax (0.87±0.11 vs 1.14±0.09, P<0.05) were decreased significantly, and the expression of Bcl2(1.15±0.12 vs 0.88±0.12, P<0.05) was increased significantly as compared with that in I/R group. CONCLUSION: Tetramethylpyrazine can attenuate kidney I/R injury, and protective mechanism may be partly through inhibition of cell apoptosis by regulating the expressions of apoptosisrelated genes Bcl2 and Bax.

  【Keywords】 tetramethylpyrazine; kidney; reperfusion injury; apoptosis; protection

  0 引言

  川芎嗪是从伞形科植物川芎根茎中分离提纯的一种生物碱单体,其基本化学结构为四甲基吡嗪,具有扩张血管、改善微循环等作用,临床上广泛用于心脑血管疾病的治疗,并取得较好疗效. 川芎嗪对肾脏缺血/再灌注(I/R)损伤的保护作用已被大量研究证实[1-2],但这种保护作用的机制尚不完全清楚,我们通过观察川芎嗪对I/R损伤大鼠肾功能、肾组织形态学、细胞凋亡及Bcl2和Bax蛋白表达的影响,进一步探讨川芎嗪对肾I/R损伤的保护作用机制.

  1 材料和方法

  1.1 材料 健康成年Wistar大鼠40只,雌雄不拘,体质量200~240 g(第四军医大学实验动物中心),动物许可证号SCXK(军2002005),标准饲料,自由进食水,普通光照. 兔抗大鼠Bcl2和Bax mAb、兔抗βactin(Santa Cruz公司);免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程公司);原位细胞凋亡(TUNEL)试剂盒(美国Roche公司);细胞裂解液(美国BDBiosciences公司);BCA试剂盒(美国Pierce公司);SDS聚丙烯酰胺凝胶(美国Invitrogen公司);硝酸纤维素膜(美国Life Science公司);血尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);川芎嗪注射液(无锡第七制药厂,批号02081911). JEM100SX型透射电镜(日本JEOL公司),凝胶图像分析系统(美国Kodak公司)等.

  1.2 方法

  1.2.1 分组及动物模型制备 将40只大鼠随机分为4组,每组10只. S组:假手术对照组;I/R组:缺血再灌注模型组;TMPpost组:在I/R模型的基础上,再灌注30 min后腹腔注射川芎嗪,32 mg/kg,每6 h 1次,共4次;TMPpre组:在制备I/R模型前24,16,8 h,45 min腹腔注射川芎嗪, 32 mg/kg,I/R造模后不再注射川芎嗪. I/R模型制作参照Basile等方法进行[3],用30 g/L戊巴比妥钠30~50 mg/kg腹腔注射麻醉,经腹正中切口暴露双侧肾脏,游离肾蒂,用无损伤动脉夹同时钳夹双侧肾动脉,阻断45 min后松开动脉夹. 假手术组仅游离双侧肾脏,暴露60 min后再关闭腹腔切口. 24 h后再用戊巴比妥钠麻醉大鼠,采血并摘取左肾,血标本以4000 r/min 离心10 min,分离血清,置-20℃保存用于测定BUN和Cr. 取部分肾组织分别用40 g/L甲醛和30 mL/L戊二醛固定以制备石蜡切片和电镜切片,另取部分肾组织迅速置入液氮中,然后于-80℃冰箱保存,用于提取蛋白.

  1.2.2 肾功能测定 测定血BUN采用二乙酰一肟显色法,测定血Cr采用碱性苦味酸比色法,应用721分光光度计测定.

  1.2.3 肾组织学观察 石蜡切片行HE和PAS染色,光镜下观察肾组织形态学改变,参照Paller等方法进行评分[4],每只大鼠肾组织随机选择10个视野(×200),每个视野下随机选择10处肾小管,共按100个肾小管计分,分数越高表示肾小管损伤程度越严重. 电镜切片行醋酸铀和枸橼酸铅染色,在透射电镜下观察肾组织的超微结构变化.

  1.2.4 肾组织细胞凋亡检测 采用TUNEL检测细胞凋亡指数,参照TUNEL试剂盒说明书进行,显色采用DAB试剂盒进行. 光镜观察凋亡细胞,胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞. 于阳性表达分布区域、光镜200倍下随机选择5个无重叠视野,计数阳性细胞,以凋亡阳性细胞数占总细胞数的百分比作为细胞凋亡指数(AI).

  1.2.5 肾组织Bcl2,Bax免疫组化染色 采用兔抗鼠Bcl2和Bax mAb,参照抗Bcl2和Bax试剂盒进行,显色采用DAB试剂盒进行. 光镜观察胞质中有棕色颗粒者为阳性细胞.

  1.2.6 Western Blot检测肾组织Bcl2,Bax蛋白表达 称取肾组织,按常规加入细胞裂解液,进行组织匀浆,取上清液用BCA试剂盒进行蛋白定量,经100℃ 10 min 变性后,用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离. 电泳后电转移至硝酸纤维素膜上,用丽春红染液染膜,脱脂奶粉于室温封闭,与Bcl2,Bax抗体37℃孵育4℃过夜. 摇洗并加入二抗室温孵育,再次洗涤,滴加显色液至硝酸纤维素膜上,X光胶片感光,用Kodak凝胶图像分析系统进行灰度扫描.

  统计学处理:计量资料用 x±s表示,多组样本均数之间比较采用单因素方差分析,各组间的两两比较采用多个均数间的多重比较(Dunnettt检验),应用SPSS13.0统计软件,P<0.05为差异有统计学意义.

  2 结果

  2.1肾功能的变化 各组血BUN和Cr变化见表1.

  表1 各组血BUN和Cr、凋亡指数及肾小管损伤程度评分的比较(略)

  aP<0.05,bP<0.01vs I/R组. S:对照组;I/R:缺血/再灌注组;TMPpost:I/R造模后给予川芎嗪;TMPpre:I/R造模前给予川芎嗪.

  2.2 肾组织形态学改变 各组肾小管损伤程度评分结果见表1. S组光镜观察肾组织无明显病变,电镜亦未见明显异常. I/R组光镜可见皮髓间有明显淤血带,肾小管上皮细胞刷状缘消失,出现空泡、滴状变性,严重者细胞脱落、坏死、基底膜裸露. TMPpost组光镜改变较I/R组有所减轻,而TMPpre组光镜改变较I/R组明显减轻,表现为部分肾小管上皮细胞刷状缘脱落、空泡及滴状变性少见、部分管腔扩张、可见少量管型. I/R组电镜可见部分肾小管上皮细胞核染色质致密,成团块状附在核膜上,出现染色质边集,上皮细胞空泡变性、刷状缘消失、线粒体减少或消失、内质网扩张. TMPpost组肾小管细胞超微结构损伤较I/R组有所减轻. TMPpre组肾小管上皮细胞超微结构损伤程度较I/R组明显减轻:表现为肾小管上皮细胞大部分结构相对完整,线粒体肿胀,少见空泡形成,核膜完整.

  2.3肾组织细胞凋亡的变化 各组肾组织细胞凋亡指数见表1,TUNEL检测肾组织凋亡细胞结果见图1.

  A:对照组;B:缺血/再灌注(I/R)组;C:I/R造模后给予川芎嗪;D:I/R造模前给予川芎嗪.

  图1 各组TUNEL免疫组化染色 SABC ×400(略)

  2.4 Bcl2,Bax蛋白表达 在TMPpre组肾小管上皮细胞中Bcl2表达明显,而Bax在I/R组肾小管上皮细胞中表达明显(图2,3). Western Blot检测支持肾组织免疫组化染色的结果,采用灰度扫描显示Bcl2在TMPpre组表达最高,而Bax在I/R组表达最高(图4,5).

  3 讨论

  肾脏I/R损伤是休克、严重创伤及肾移植过程中一种常见的病理生理现象,可以导致急性肾衰竭(ARF)和移植肾功能丧失,在这一过程中最先受到损伤的细胞是肾小管上皮细胞. 研究表明[5],肾脏I/R损伤后除发生细胞坏死外,细胞凋亡也是其重要的死亡形式. 细胞凋亡受多种凋亡相关基因及其蛋白的调控,Bcl2家族就是其中之一,对细胞凋亡起着重要的调控作用[6]. 大量的研究[7-8]证实缺血性ARF时存在肾脏细胞凋亡,本研究得出了相似的结果:I/R组肾功能损伤明显,凋亡细胞数量增多,提示肾脏细胞凋亡数量与肾功能损伤程度密切相关.

  A:对照组;B:缺血/再灌注(I/R)组;C:I/R造模后给予川芎嗪;D:I/R造模前给予川芎嗪.

  图2 各组Bcl2免疫组化染色 SABC ×400(略)

  凋亡是缺血性损伤后细胞死亡的重要形式,细胞凋亡受多种凋亡相关基因及其蛋白的调控,与凋亡相关的基因通常分为抗凋亡基因和促凋亡基因. Bcl2是一种重要的抗凋亡基因蛋白,而Bax为Bcl2 家族成员,其作用则与Bcl2 相反,具有促凋亡作用. Reed[9]认为,Bcl2高表达或Bcl2/Bax比值升高可抑制Bax的活化,从而抑制细胞凋亡. 本研究结果显示,应用川芎嗪能使肾脏I/R过程中细胞凋亡指数下降,Bcl2蛋白表达增强,Bax 蛋白表达减弱,Bcl2/Bax比值增高. 表明川芎嗪能抑制肾脏I/R过程中肾脏细胞凋亡的发生,且川芎嗪的肾脏保护作用与抑制Bcl2/Bax介导的细胞凋亡密切相关,提示在肾脏I/R损伤中,细胞凋亡是可以预防的.

  大量的研究[10-11]证实川芎嗪对I/R损伤的肾脏有明显的保护作用. 本研究结果表明,肾脏I/R前后应用川芎嗪均具有肾脏保护作用,在I/R前给予川芎嗪效果更明显,表现在TMPpre组肾功能明显好转,肾小管上皮细胞超微结构损伤明显减轻. 我们推测:早期应用川芎嗪能在肾脏缺血期及再灌注早期对抗细胞损伤因子,稳定线粒体膜,从而更好地保护肾脏细胞,而晚期给药则难以在短期内缓解细胞已遭受的严重损伤.

  本研究可得出以下结论:肾脏I/R损伤时细胞凋亡数量增加,Bcl2和Bax 蛋白表达较正常增强,Bcl2/Bax比值下降,肾功能恶化. I/R前应用川芎嗪能减少肾脏细胞凋亡,上调Bcl2蛋白并同时下调Bax 蛋白的表达,明显改善肾功能. 因此,川芎嗪对肾脏I/R损伤,可通过调节Bcl2和Bax蛋白的表达,抑制细胞凋亡起到肾脏保护作用.

  【参考文献】

  [1] Feng L, Xiong Y, Cheng F, et al. Effect of ligustrazine on ischemiareperfusion injury in murine kidney[J]. Transplant Proc, 2004, 36(7):1949-1951.

  [2] 王 忠,翁国星,杜 建. 川芎嗪对缺血再灌注肾保护作用的研究[J]. 福建中医学院学报,2005,15(2):26-27.

  [3] Basile DP, Donohoe D, Cao X, et al. Resistance to ischemic acute renal failure in the Brown Norway rat: a new model to study cytoprotection[J]. Kidney Int, 2004, 65(6):2201-2211.

  [4] Paller MS, Hoidal JR, Ferris TF. Oxygen free radicals in ischemic acute renal failure in the rat[J]. J Clin Invest, 1984, 74(4):1156-1164.

  [5] Nogae S, Miyazaki M, Kobayashi N, et al. Induction of apoptosis in ischemiareperfusion model of mouse kidney: possible involvement of Fas[J]. J Am Soc Nephrol, 1998, 9(4):620-631.

  [6] Devarajan P, Mishra J, Supavekin S, et al. Gene expression in early ischemic renal injury: clues towards pathogenesis, biomarker discovery, and novel therapeutics[J]. Mol Gene Metab, 2003, 80(4):365-376.

  [7] Saikumar P, Venkatachalam MA. Role of apoptosis in hypoxic/ischemic damage in the kidney[J]. Semin Nephrol, 2003, 23(6):511-521.

  [8] 谭 华,王汉民,潘 龙,等. 缺血预处理对大鼠急性肾缺血/再灌注损伤的保护作用及其对细胞凋亡的影响[J]. 第四军医大学学报,2004,25(9):818-821.

  [9]Reed JC. Proapoptotic multidomain Bcl2/Baxfamily proteins: mechanisms, physiological roles, and therapeutic opportunities[J].Cell Death Differ, 2006, 13(8):1378-1386.

  [10] Sun L, Li Y, Shi L, et al. Protective effects of ligustrazine on ischemiareperfusion injury in rat kidneys[J]. Microsurgery, 2002, 22(8):343-346.

  [11] 王汉民,吴雄飞,谭 华,等. 川芎嗪对缺血/再灌注损伤大鼠肾脏细胞凋亡及Bcl2和Bax表达的影响[J]. 第四军医大学学报,2006,27(20):1884-1887.



 
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